注:a. 与对照组比较,P<0.05;b. 与对照组比较,P<0.01。
2.2 NaF 浓度和作用时间对 RAW264.7 细胞活力的 影响 0 mg/L时,48 h和72 h的细胞OD值均高于24h 的 OD 值,差异有统计学意义(t=5.21、6.03,P<0.05);72 h 的细胞 OD 值低于 48 h 的 OD 值,差异有统计学意义(t=4.77,P<0.05)。在NaF浓度为2 mg/L时,48 h的 OD 值高于 72 h 的 OD 值,差异有统计学意义(t=9.91,P<0.05);48 h 和 72 h 的细胞 OD 值均高于 24 h的OD值,即0 mg/L和2 mg/L组的3个时间OD值变化规律一致。当NaF浓度≥10 mg/L 时,48 h 的细胞OD 值均高于 24 h,但 72 h 均下降,且与 24 h 的细胞OD 值比较差异无统计学意义(t=0.21,P>0.05)。当NaF 浓度为 80 mg/L 时,3 个时间点的细胞活力差异无统计学意义(t=1.76,P>0.05)。
2.3 氟对体外诱导分化培养的破骨细胞 MMP-9 和组织蛋白酶K蛋白质表达的影响 氟对两种蛋白表达的影响结果见表2和表3。实验结果表明,在(10~40)mg/L 氟浓度作用 48 h 能使破骨细胞内 MMP-9 升高,差异有统计学意义(t=6.51,P<0.05);在24 h和72h 各剂量的氟对细胞内的 MMP-9 蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(t=1.09,P>0.05)。而氟对组织蛋白酶K的表达只在80 mg/L氟作用72 h时,能显著降低在破骨细胞内的表达。
表2 氟对破骨细胞MMP-9蛋白质表达的影响(x ±s)
注:a. 与对照组比较,P<0.05。
表3 氟对破骨细胞组织蛋白酶K蛋白质表达的影响(x ±s)
注:a. 与对照组比较,P<0.05。
3 讨 论
小鼠RAW264.7细胞作为一种单核巨噬细胞系,是体外研究破骨细胞分化的经典细胞系,因为该细胞系可以在RANKL诱导的情况下稳定分化为形态和功能均成熟的破骨细胞。本研究发现:①时间与NaF浓度交互作用对RAW264.7细胞活力的影响:NaF浓度对RAW264.7细胞活力有抑制作用,但并未使细胞死亡,而是细胞活性降低。随着时间延长,细胞活性逐渐增强,说明NaF对RAW264.7细胞活力的抑制是暂时性的,随着时间的延长NaF对RAW264.7细胞活力 的 抑 制 作 用 在 减 弱 。 ② 本 实 验 未 见 NaF 对RAW264.7 细胞活力有促进作用。NaF 只是暂时取代了RAW264.7细胞与活力有关的代谢因子,如果NaF浓度与此因子相当,则代谢平衡不变;如NaF浓度为20 mg/L(浓度高或低),与此因子浓度不相当,则暂时打破了这种平衡,但这种取代可能是可逆的,随时间延长而恢复,即NaF对RAW264.7细胞的作用是有限的。这种因子可能与RAW264.7细胞的周期活动相关的基因有关。龙丽、马雷等研究发现,氟对破骨细胞的作用剂量过低(F含量远小于1 mg/L),所得结果与常识不符合,很可能与选择兔细胞有关。本研究的结果与华坤、范哲和杜光等的研究基本一致,区别在本研究的剂量范围较广。氟对破骨细胞具有直接的作用,从细胞活力看,早期(24 h)以损伤作用为主,但在48 h显示细胞从损伤状态恢复。
MMP-9 主要在破骨细胞、骨髓单核细胞和一些骨基质表面衬细胞中表达。MMP-9通过降解细胞外基质,在破骨细胞的迁移、侵蚀和锚着过程中发挥作用,应用免疫组织化学方法观察氟对培养的大鼠破骨细胞MMP-9的影响,结果表明,随染氟剂量的增加,MMP-9阳性细胞数逐渐增多,以10mg/L、20mg/L、40 mg/L 组最为明显,与对照组比较差异有统计学意义(t=6.51,P<0.05)。说明氟可通过提高MMP-9的蛋白质表达引起骨吸收活性的增加。
组织蛋白酶K(cathepsin K)属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族成员,1999年克隆成功,又称作 cathepsin O2,cathepsin X,cathepsin O。与其他组织蛋白酶不同,组织蛋白酶K具有分解骨组织中主要胶原(Ⅰ型胶原)的端肽区及螺旋状结构的能力发挥降解骨胶原的功能。而Ⅰ型胶原蛋白是含量最多的骨基质蛋白,占整个基质的90%,它在骨吸收过程中发挥重要的作用。在溶骨过程中参与骨基质降解的酶主要有两种—半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMPs),其中发挥主要作用的是半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶K,它选择性地大量表达于破骨细胞,其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原,除此之外还能降解骨基质中的骨桥接素(osteopontin)和骨连接素(osteonectin),是破骨细胞中表达量最高、溶骨活性最强的的一种半胱氨酸蛋白酶,它对成骨胶原的降解能力远远高于其他各种MMPs,是骨吸收过程中的一个关键酶。但本研究中各浓度的氟对破骨细胞的组织蛋白酶K表达影响较小,可能不是氟作用的靶点。本研究结果尚需在动物体内实验以及人体实验中验证。